為什么要標(biāo)定色譜呢？因?yàn)樯V本身是無法自己定量的，必須依賴標(biāo)準(zhǔn)物來標(biāo)定檢測(cè)器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度的響應(yīng)值，然后根據(jù)未知組分的響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)組分的對(duì)比，確定未知組分的濃度。色譜儀的標(biāo)定方法包括內(nèi)標(biāo)法、百分比法（面積歸一化法）、帶校正因子的面積歸一化法、外標(biāo)法等。本文主要介紹外標(biāo)法的標(biāo)定。
理論上來說，檢測(cè)器是線性響應(yīng)的，而且過零點(diǎn)，因此外標(biāo)法的公式是c=gA。這里c是待測(cè)組分濃度，g是絕對(duì)校正因子，A是峰面積。從這個(gè)公式上看，我們?cè)谶@個(gè)直線上選取任意一點(diǎn)（c，A），都可以得到校正因子g。也就是說，只要有任意一個(gè)已知濃度的標(biāo)樣，到色譜儀上分析一次，就能得到準(zhǔn)確可靠的絕對(duì)校正因子g了。
但實(shí)際情況并不如此。我們還要考慮很多因素。這些因素包括以下幾點(diǎn)。
一、檢測(cè)器的線性區(qū)間
檢測(cè)器的線性并不是無限長(zhǎng)的。在定量下限之下，響應(yīng)曲線是不存在的。因此標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不能低于定量下限。這是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物濃度的第一條要求。
同時(shí)，當(dāng)濃度足夠高，到達(dá)定量上限的時(shí)候，響應(yīng)曲線就真的變成曲線了，會(huì)向下彎曲。因此對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物濃度的第二條要求是標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不能高于定量上限。
二、基線噪聲的固定誤差
是否標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度在定量下限和定量上限之間就沒問題了呢？也不是，因?yàn)槲覀儽仨毧紤]誤差。
和大多數(shù)分析儀器一樣，色譜定量的誤差也包括兩部分，即一個(gè)小的固定的絕對(duì)誤差，和一個(gè)用百分?jǐn)?shù)表達(dá)的相對(duì)誤差。色譜定量誤差的絕對(duì)誤差部分，主要來源于基線噪聲。下面這個(gè)圖，是一個(gè)放大的色譜基線和峰的圖。
從這個(gè)圖中，兩條蘭線之間的黑色折線是色譜基線。我們知道，色譜的基線總是有一定寬度的，當(dāng)色譜峰出來后，在正確的積分條件下，藍(lán)線上面的綠色面積一定會(huì)得到準(zhǔn)確積分。但基線寬度內(nèi)的紅色部分，就不確定了。
因?yàn)榉迤瘘c(diǎn)和終點(diǎn)每次并不完全確定在基線寬度的固定位置，因此紅色部分的面積，可能完全進(jìn)入峰面積積分值內(nèi)，也可能完全不進(jìn)入，也可能部分進(jìn)入。因此這個(gè)峰面積就會(huì)有這個(gè)紅色部分大小的固定隨機(jī)誤差。
為什么這個(gè)隨機(jī)誤差是固定大小，不隨著峰面積大小而變化呢？其實(shí)這個(gè)說法是有一定條件的，就是峰寬必須是不變的。只要峰寬不變，基線噪聲寬度也不變，那么這個(gè)面積就是固定的了。對(duì)于某個(gè)組分來說，只要色譜柱沒有超載，無論這個(gè)組分的濃度是多少，峰寬就是一定的。所以，在不超載的情況下，也就是絕大多數(shù)情況下，這個(gè)隨機(jī)誤差都是固定的了。
這個(gè)固定誤差非常關(guān)鍵。因?yàn)樵诓煌瑵舛认拢@個(gè)誤差是固定的，所以測(cè)量點(diǎn)帶上這個(gè)固定誤差，就相當(dāng)于下圖中的紅色方塊了。本來理想的響應(yīng)曲線，或者說我們標(biāo)定得到的工作曲線，應(yīng)該是綠色線。但因?yàn)閱未螠y(cè)量存在這樣一個(gè)固定的誤差，因此我們?cè)谧畈恍业那闆r下可能實(shí)際得到的是藍(lán)色和粉色線。
藍(lán)色線是標(biāo)樣濃度比較低的情況下得到的；粉色線是標(biāo)樣濃度比較高的情況下得到的�？梢悦黠@看到，粉色線更接近綠色的理想標(biāo)線。這是因?yàn)闈舛雀�，這個(gè)固定的隨機(jī)誤差相對(duì)就非常小，極端情況對(duì)標(biāo)線的影響就很小了。
這個(gè)情況對(duì)我們來說很重要。因?yàn)橐坏┮驑?biāo)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)組分峰面積的隨機(jī)誤差而發(fā)生標(biāo)線偏移，這個(gè)隨機(jī)誤差會(huì)被標(biāo)線所固化，成為樣品分析中的系統(tǒng)誤差。也就是說，會(huì)在每一次分析中出現(xiàn)，而且實(shí)際樣品濃度越大，偏離越遠(yuǎn)。
三、標(biāo)準(zhǔn)樣品中濃度的問題
標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度應(yīng)該在定量下限和定量上限之間，并且更靠近定量上限。
這個(gè)結(jié)論對(duì)很多朋友來說很難接受，甚至是顛覆性的。因?yàn)楹芏嗌V技術(shù)員他們的色譜標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度都是很低的，一般都是控制指標(biāo)要求的控制濃度。在很多情況下，這個(gè)控制濃度非常接近定量下限，而不是上限。他們都說，“我這個(gè)標(biāo)樣就是控制指標(biāo)的，樣品的峰面積比標(biāo)樣大，就是不合格；比標(biāo)樣小，就合格。這樣的標(biāo)樣才準(zhǔn)確可靠�！边@個(gè)想法是好的，但現(xiàn)實(shí)是殘酷的。因?yàn)槊看畏治�，峰面積都存在一個(gè)固定的基線噪聲導(dǎo)致的面積誤差，因此哪怕你重復(fù)分析兩次標(biāo)樣，你也無法得到兩個(gè)相同的峰面積。這時(shí)你會(huì)發(fā)現(xiàn)，用高濃度標(biāo)樣標(biāo)定的曲線，分析結(jié)果的可能最大誤差要小于用低濃度標(biāo)定的分析結(jié)果。如上圖中的粉色方塊（粉色標(biāo)線的極限誤差）和藍(lán)色方塊（藍(lán)色標(biāo)線的極限誤差）。
所以，當(dāng)我們選擇單點(diǎn)標(biāo)定的時(shí)候，請(qǐng)盡量不要選擇過低的濃度，因?yàn)檫@樣分析結(jié)果的誤差大。
四、進(jìn)樣量等的相對(duì)誤差
影響標(biāo)定的，還有進(jìn)樣量、檢測(cè)器漂移、分流比變化等條件導(dǎo)致的相對(duì)誤差。
我們知道，這些色譜條件其實(shí)都不是固定的。每次進(jìn)樣，進(jìn)樣量總是會(huì)有一個(gè)微小的誤差，檢測(cè)器響應(yīng)也可能隨著各種條件發(fā)生一點(diǎn)點(diǎn)差異。這個(gè)差異的絕對(duì)大小并不固定，而是和樣品中組分含量密切相關(guān)。組分含量大，這個(gè)差異也就會(huì)被相應(yīng)的放大一點(diǎn)；組分含量小，這個(gè)差異也就相應(yīng)小一點(diǎn)。
但是當(dāng)我們正確選擇了高濃度標(biāo)樣之后，固定誤差已經(jīng)很小可以忽略的時(shí)候，這個(gè)相對(duì)誤差才是我們標(biāo)定的主要誤差來源，一樣會(huì)固化在標(biāo)線中成為系統(tǒng)誤差，我們?nèi)绾文軌虿辉诤跛�？我們其�?shí)非常在乎這個(gè)隨機(jī)誤差的。只不過這個(gè)誤差對(duì)我們的影響不是標(biāo)樣濃度，是標(biāo)定方式。我們知道，隨機(jī)誤差服從正態(tài)分布，多次測(cè)量取平均值，可以有效減小隨機(jī)誤差。所以，要減小這個(gè)隨機(jī)誤差的影響，許多進(jìn)行多次標(biāo)定，并取平均值。從理論上來說，標(biāo)定次數(shù)多多益善；但從實(shí)際工作強(qiáng)度來看，這個(gè)次數(shù)越少越好。因此我們必須折衷。在數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)上看，20次即可認(rèn)為是無限多次，6次即可認(rèn)為是有限的無限多次。所以，我建議標(biāo)定的時(shí)候選擇6平行。
這個(gè)圖上面是隨機(jī)誤差t分布表達(dá)公式。u是真實(shí)值，x是多次分析的平均值，t是t分布表值（就是圖下面表里面的值，與測(cè)量次數(shù)和置信度有關(guān)），s是樣本偏差，n是測(cè)量次數(shù)。這個(gè)公式后面的ts/根號(hào)n就是多次測(cè)量平均值的隨機(jī)誤差了。
計(jì)算一下就會(huì)知道，在95%置信度下，當(dāng)方法的s保持不變的情況下，2平行的隨機(jī)誤差大約是9s，6平行的隨機(jī)誤差大約是1s，6平行的隨機(jī)誤差要小10倍左右，即低一個(gè)數(shù)量級(jí)。而這正是我們所需要的：標(biāo)定結(jié)果要比分析結(jié)果的隨機(jī)誤差小一個(gè)數(shù)量級(jí)。
只有這樣，才能保證標(biāo)定隨機(jī)誤差固化在標(biāo)線內(nèi)之后變成的系統(tǒng)誤差，對(duì)實(shí)際樣品分析結(jié)果的影響可以忽略。因?yàn)樗∫粋�(gè)數(shù)量級(jí)了。
所以，標(biāo)線標(biāo)定要連續(xù)重復(fù)標(biāo)定6次，取平均值，制作標(biāo)線。那是不是每天都得忙著標(biāo)定色譜了，其實(shí)，色譜儀沒大的變化，僅僅是你對(duì)色譜長(zhǎng)時(shí)間工作有些懷疑的時(shí)候，你不需要標(biāo)定色譜，你只需要檢驗(yàn)標(biāo)線即可。所謂檢驗(yàn)標(biāo)線，就是進(jìn)樣分析一次標(biāo)準(zhǔn)樣品，得到的結(jié)果與標(biāo)稱值相比，在允許的誤差范圍內(nèi)，就說明標(biāo)線仍然有效。所以，當(dāng)你對(duì)標(biāo)線有懷疑的時(shí)候，還是只要進(jìn)樣分析一次標(biāo)準(zhǔn)樣品就好了。而且，你還不需要用這個(gè)結(jié)果重新制作標(biāo)線，因?yàn)槔系臉?biāo)線更可靠，所以你比以前省事了。只有當(dāng)誤差超過允許范圍，才需要再次標(biāo)定色譜儀。當(dāng)然，定期，例如每半年，標(biāo)定一次色譜儀也是極好的。多標(biāo)定總是沒壞處。
所以，我們要記得：定期標(biāo)定色譜儀，隨時(shí)抽查檢驗(yàn)標(biāo)線。
五、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)確性
標(biāo)樣的標(biāo)稱濃度并不是非�？煽康模灿姓`差，或者說不確定度。好的廠家生產(chǎn)的每瓶標(biāo)樣上面都標(biāo)有不確定度。例如U=2%，k=2，這個(gè)k=2，表明是95%的置信度。這個(gè)U=2%，表明不確定度為2%。什么是不確定度呢？其實(shí)就是誤差的另一種說法而已。就是說，這個(gè)標(biāo)樣生產(chǎn)出來濃度值的隨機(jī)誤差是2%。
如果你仔細(xì)看標(biāo)樣說明書，就會(huì)發(fā)現(xiàn)，濃度越低，組分越罕見，這個(gè)U就越大，甚至達(dá)到10%、20%。但是這個(gè)隨機(jī)誤差是要被固化在標(biāo)線中，成為樣品分析的系統(tǒng)誤差的，光標(biāo)樣就有10%的系統(tǒng)誤差，而且是我們無法消除的系統(tǒng)誤差，這如何得了？所以，我們需要幫助標(biāo)準(zhǔn)氣生產(chǎn)廠家，定制高濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣，生產(chǎn)廠家明顯會(huì)輕松很多，U會(huì)小很多。
所以高濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣，擁有更低的標(biāo)稱值隨機(jī)誤差。
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